रुग्णाच्या सीरमच्या उच्च-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषणाचा वापर करून उच्च विशिष्टतेसह सौम्य आणि घातक फुफ्फुसीय नोड्यूलमध्ये फरक करणारे मेटाबोलॉमिक्स.

संगणकीय टोमोग्राफी (CT) द्वारे ओळखल्या गेलेल्या फुफ्फुसातील गाठींचे विभेदक निदान हे वैद्यकीय व्यवहारात एक आव्हान आहे. येथे, आम्ही निरोगी व्यक्ती, फुफ्फुसातील सौम्य गाठी आणि पहिल्या टप्प्यातील फुफ्फुसाचा ॲडेनोकार्सिनोमा यांसह ४८० सीरम नमुन्यांच्या संपूर्ण मेटाबोलॉमचे वैशिष्ट्यीकरण केले आहे. ॲडेनोकार्सिनोमा अद्वितीय मेटाबोलॉमिक प्रोफाइल दर्शवतात, तर सौम्य गाठी आणि निरोगी व्यक्तींच्या मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलमध्ये उच्च समानता आढळते. डिस्कव्हरी ग्रुपमध्ये (n = ३०६), सौम्य आणि घातक गाठींमध्ये फरक करण्यासाठी २७ मेटाबोलाइट्सचा एक संच ओळखण्यात आला. अंतर्गत प्रमाणीकरण (n = १०४) आणि बाह्य प्रमाणीकरण (n = १११) गटांमध्ये डिस्क्रिमिनांट मॉडेलचा AUC अनुक्रमे ०.९१५ आणि ०.९४५ होता. पाथवे विश्लेषणातून असे दिसून आले की, सौम्य गाठी आणि निरोगी व्यक्तींच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या सीरममध्ये ट्रिप्टोफॅन कमी झाल्यामुळे ग्लायकोलिटिक मेटाबोलाइट्स वाढले होते, आणि यावरून असे सूचित होते की ट्रिप्टोफॅनचे ग्रहण फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या पेशींमध्ये ग्लायकोलिसिसला प्रोत्साहन देते. आमचा अभ्यास सीटी स्कॅनद्वारे आढळलेल्या फुफ्फुसातील गाठींच्या धोक्याचे मूल्यांकन करण्यासाठी सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्कर्सचे महत्त्व अधोरेखित करतो.
कर्करोगाच्या रुग्णांचे जगण्याचे प्रमाण सुधारण्यासाठी लवकर निदान करणे अत्यंत महत्त्वाचे आहे. यूएस नॅशनल लंग कॅन्सर स्क्रीनिंग ट्रायल (NLST) आणि युरोपियन नेल्सन स्टडीच्या निकालांवरून असे दिसून आले आहे की, लो-डोस कम्प्युटेड टोमोग्राफी (LDCT) द्वारे तपासणी केल्यास उच्च-जोखीम गटांमध्ये फुफ्फुसाच्या कर्करोगामुळे होणारे मृत्यू लक्षणीयरीत्या कमी होऊ शकतात¹,²,³. फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या तपासणीसाठी LDCT चा व्यापक वापर सुरू झाल्यापासून, लक्षणे नसलेल्या फुफ्फुसीय गाठींच्या (पल्मोनरी नोड्यूल्स) अपघाती रेडिओग्राफिक निष्कर्षांचे प्रमाण सतत वाढत आहे⁴. फुफ्फुसीय गाठी म्हणजे ३ सेमी व्यासापर्यंतच्या स्थानिक अपारदर्शक जागा (फोकस ओपॅसिटीज) अशी व्याख्या केली जाते⁵. कर्करोगाची शक्यता तपासण्यात आणि LDCT वर अपघाताने आढळलेल्या मोठ्या संख्येने फुफ्फुसीय गाठींना हाताळण्यात आपल्याला अडचणी येतात. सीटी स्कॅनच्या मर्यादांमुळे वारंवार पाठपुरावा तपासण्या आणि चुकीचे-सकारात्मक (फॉल्स-पॉझिटिव्ह) निकाल येऊ शकतात, ज्यामुळे अनावश्यक हस्तक्षेप आणि अतिरिक्त उपचार होऊ शकतात⁶. म्हणून, फुफ्फुसाचा कर्करोग सुरुवातीच्या टप्प्यात अचूकपणे ओळखण्यासाठी आणि प्राथमिक निदानात बहुतेक सौम्य गाठींमध्ये फरक करण्यासाठी विश्वसनीय आणि उपयुक्त बायोमार्कर्स विकसित करण्याची गरज आहे⁷.
रक्ताचे (सीरम, प्लाझ्मा, पेरिफेरल ब्लड मोनोन्यूक्लियर सेल्स) जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स किंवा डीएनए मिथायलेशन8,9,10 यांसारख्या व्यापक आण्विक विश्लेषणामुळे फुफ्फुसाच्या कर्करोगासाठी निदानात्मक बायोमार्कर्सच्या शोधात रस वाढत आहे. दरम्यान, मेटाबोलॉमिक्स पद्धती अंतर्गत आणि बाह्य क्रियांमुळे प्रभावित होणाऱ्या पेशीय अंतिम उत्पादनांचे मापन करतात आणि म्हणूनच त्यांचा उपयोग रोगाची सुरुवात आणि परिणाम यांचा अंदाज घेण्यासाठी केला जातो. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) ही मेटाबोलॉमिक्स अभ्यासासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरली जाणारी पद्धत आहे, कारण तिची उच्च संवेदनशीलता आणि मोठी डायनॅमिक रेंज, जी विविध भौतिक-रासायनिक गुणधर्म असलेल्या मेटाबोलाइट्सना समाविष्ट करू शकते11,12,13. जरी प्लाझ्मा/सीरमच्या जागतिक मेटाबोलॉमिक विश्लेषणाचा उपयोग फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या निदानाशी14,15,16,17 आणि उपचारांच्या परिणामकारकतेशी18 संबंधित बायोमार्कर्स ओळखण्यासाठी केला गेला असला तरी, सौम्य आणि घातक फुफ्फुसाच्या गाठींमध्ये फरक करण्यासाठी सीरम मेटाबोलाइट वर्गीकरणकर्त्यांवर अजूनही बरेच संशोधन होणे बाकी आहे.
ॲडेनोकार्सिनोमा आणि स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा हे नॉन-स्मॉल सेल लंग कॅन्सरचे (NSCLC) दोन मुख्य उपप्रकार आहेत. विविध सीटी स्क्रीनिंग चाचण्या दर्शवतात की ॲडेनोकार्सिनोमा हा फुफ्फुसाच्या कर्करोगाचा सर्वात सामान्य हिस्टोलॉजिकल प्रकार आहे¹,¹⁹,²⁰,²¹. या अभ्यासात, आम्ही स्टेज I फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या स्क्रीनिंगसाठी, निरोगी व्यक्ती, सौम्य फुफ्फुसीय गाठी आणि सीटी-द्वारे शोधलेल्या ≤३ सेमी आकाराच्या नमुन्यांसह एकूण ६९५ सीरम नमुन्यांवर मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण करण्यासाठी अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-हाय-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) वापरली. आम्ही सीरम मेटाबोलाइट्सचा एक पॅनेल ओळखला, जो फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाला सौम्य गाठी आणि निरोगी व्यक्तींपासून वेगळे करतो. पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषणातून असे दिसून आले की, सौम्य गाठी आणि निरोगी व्यक्तींच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमामध्ये असामान्य ट्रिप्टोफॅन आणि ग्लुकोज चयापचय हे सामान्य बदल आहेत. शेवटी, आम्ही LDCT द्वारे शोधलेल्या घातक आणि सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूलमध्ये फरक करण्यासाठी उच्च विशिष्टता आणि संवेदनशीलता असलेला एक सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायर स्थापित आणि प्रमाणित केला, जो लवकर विभेदक निदान आणि जोखीम मूल्यांकनासाठी मदत करू शकतो.
सध्याच्या अभ्यासात, १७४ निरोगी व्यक्ती, २९२ सौम्य फुफ्फुसीय गाठी असलेले रुग्ण आणि २२९ पहिल्या टप्प्यातील फुफ्फुसाचा कर्करोग (अ‍ॅडेनोकार्सिनोमा) असलेल्या रुग्णांकडून लिंग आणि वयानुसार जुळणारे रक्ताचे नमुने पूर्वलक्षी पद्धतीने गोळा करण्यात आले. ६९५ व्यक्तींची लोकसांख्यिकीय वैशिष्ट्ये परिशिष्ट सारणी १ मध्ये दर्शविली आहेत.
आकृती 1a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरमध्ये एकूण 480 सीरम नमुने गोळा करण्यात आले, ज्यात 174 निरोगी नियंत्रण (HC), 170 सौम्य गाठी (BN), आणि 136 स्टेज I फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाचे (LA) नमुने समाविष्ट होते. अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-हाय-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) वापरून अनटारगेटेड मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलिंगसाठी डिस्कव्हरी कोहोर्ट तयार करण्यात आला. पूरक आकृती 1 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, वर्गीकरण मॉडेल स्थापित करण्यासाठी आणि भिन्न मार्ग विश्लेषणाचा अधिक शोध घेण्यासाठी LA आणि HC, LA आणि BN यांच्यातील भिन्न मेटाबोलाइट्स ओळखण्यात आले. सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरने गोळा केलेले 104 नमुने आणि इतर दोन रुग्णालयांनी गोळा केलेले 111 नमुने अनुक्रमे अंतर्गत आणि बाह्य प्रमाणीकरणासाठी वापरण्यात आले.
a डिस्कव्हरी कोहोर्टमधील अभ्यास गट, ज्यांच्यावर अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-हाय-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) वापरून जागतिक सीरम मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण करण्यात आले. b अभ्यास गटातील ४८० सीरम नमुन्यांच्या एकूण मेटाबोलॉमचे पार्शियल लीस्ट स्क्वेअर्स डिस्क्रिमिनांट ॲनालिसिस (PLS-DA), ज्यामध्ये निरोगी नियंत्रक (HC, n = १७४), सौम्य गाठी (BN, n = १७०), आणि स्टेज I फुफ्फुसाचा ॲडेनोकार्सिनोमा (लॉस एंजेलिस, n = १३६) यांचा समावेश आहे. +ESI, पॉझिटिव्ह इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड, -ESI, निगेटिव्ह इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड. c–e दिलेल्या दोन गटांमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न विपुलता असलेले मेटाबोलाइट्स (टू-टेल्ड विल्कोक्सन साइन्ड रँक टेस्ट, फॉल्स डिस्कव्हरी रेट ॲडजस्टेड p व्हॅल्यू, FDR <०.०५) लाल (फोल्ड चेंज > १.२) आणि निळ्या (फोल्ड चेंज < ०.८३) रंगात दर्शविले आहेत. ) व्होल्कॅनो ग्राफिकवर दर्शविले आहे. f LA आणि BN मधील एनोटेटेड मेटाबोलाइट्सच्या संख्येत लक्षणीय फरक दर्शवणारा पदानुक्रमित क्लस्टरिंग हीट मॅप. स्रोत डेटा, स्रोत डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला आहे.
डिस्कव्हरी ग्रुपमधील 174 HC, 170 BN आणि 136 LA यांच्या एकूण सीरम मेटाबोलॉमचे विश्लेषण UPLC-HRMS विश्लेषणाचा वापर करून करण्यात आले. आम्ही प्रथम दाखवतो की क्वालिटी कंट्रोल (QC) नमुने अनसुपरवाइज्ड प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) मॉडेलच्या मध्यभागी घट्टपणे क्लस्टर होतात, जे सध्याच्या अभ्यासाच्या कामगिरीच्या स्थिरतेची पुष्टी करते (पूरक आकृती 2).
आकृती 1 ब मधील आंशिक किमान वर्ग-भेदक विश्लेषण (PLS-DA) मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, आम्हाला आढळले की सकारात्मक (+ESI) आणि नकारात्मक (−ESI) इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण पद्धतींमध्ये LA आणि BN, तसेच LA आणि HC यांच्यात स्पष्ट फरक होते. तथापि, +ESI आणि -ESI परिस्थितींमध्ये BN आणि HC यांच्यात कोणतेही लक्षणीय फरक आढळले नाहीत.
आम्हाला LA आणि HC मध्ये ३८२ भिन्न वैशिष्ट्ये, LA आणि BN मध्ये २३१ भिन्न वैशिष्ट्ये, आणि BN आणि HC मध्ये ९५ भिन्न वैशिष्ट्ये आढळली (विल्कॉक्सॉन साइन्ड रँक टेस्ट, FDR <०.०५ आणि मल्टिपल चेंज >१.२ किंवा <०.८३) (आकृती १c-e). m/z मूल्य, रिटेन्शन टाइम आणि फ्रॅगमेंटेशन मास स्पेक्ट्रम शोध वापरून एका डेटाबेसच्या (mzCloud/HMDB/Chemspider लायब्ररी) विरुद्ध पीक्सचे पुढे एनोटेशन (पूरक डेटा ३) करण्यात आले (तपशील पद्धती विभागात वर्णन केले आहेत) २२. शेवटी, LA विरुद्ध BN (आकृती १f आणि पूरक सारणी २) आणि LA विरुद्ध HC (पूरक आकृती ३ आणि पूरक सारणी २) साठी अनुक्रमे विपुलतेमध्ये लक्षणीय फरक असलेले ३३ आणि ३८ एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स ओळखले गेले. याउलट, BN आणि HC मध्ये विपुलतेमध्ये लक्षणीय फरक असलेले फक्त ३ मेटाबोलाइट्स ओळखले गेले (पूरक सारणी २), जे PLS-DA मधील BN आणि HC मधील ओव्हरलॅपशी सुसंगत आहे. हे भिन्न चयापचय घटक विविध प्रकारच्या जैवरासायनिक पदार्थांना व्यापतात (पूरक आकृती ४). एकत्रितपणे, हे परिणाम सौम्य फुफ्फुसीय गाठी किंवा निरोगी व्यक्तींच्या तुलनेत, सुरुवातीच्या टप्प्यातील फुफ्फुसांच्या कर्करोगाच्या घातक परिवर्तनाला प्रतिबिंबित करणारे सीरम मेटाबोलॉममधील महत्त्वपूर्ण बदल दर्शवतात. त्याच वेळी, बीएन (BN) आणि एचसी (HC) यांच्या सीरम मेटाबोलॉममधील साम्य असे सूचित करते की सौम्य फुफ्फुसीय गाठी निरोगी व्यक्तींसारखी अनेक जैविक वैशिष्ट्ये सामायिक करू शकतात. फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमा उपप्रकार २३ मध्ये एपिडर्मल ग्रोथ फॅक्टर रिसेप्टर (EGFR) जनुकीय उत्परिवर्तन सामान्य असल्याने, आम्ही ड्रायव्हर उत्परिवर्तनांचा सीरम मेटाबोलॉमवर होणारा परिणाम निश्चित करण्याचा प्रयत्न केला. त्यानंतर आम्ही फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमा गटातील EGFR स्थिती असलेल्या ७२ प्रकरणांच्या एकूण मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलचे विश्लेषण केले. विशेष म्हणजे, पीसीए (PCA) विश्लेषणात आम्हाला EGFR उत्परिवर्तित रुग्ण (n = ४१) आणि EGFR वाइल्ड-टाइप रुग्ण (n = ३१) यांच्यामध्ये तुलनात्मक प्रोफाइल आढळले (पूरक आकृती ५अ). तथापि, आम्ही असे ७ मेटाबोलाइट्स ओळखले ज्यांचे प्रमाण वाइल्ड-टाइप EGFR असलेल्या रुग्णांच्या तुलनेत EGFR उत्परिवर्तन असलेल्या रुग्णांमध्ये लक्षणीयरीत्या बदलले होते (टी टेस्ट, p < 0.05 आणि फोल्ड चेंज > 1.2 किंवा < 0.83) (पूरक आकृती 5b). यापैकी बहुतेक मेटाबोलाइट्स (७ पैकी ५) हे ॲसिलकार्निटाइन्स आहेत, जे फॅटी ॲसिड ऑक्सिडेशन मार्गांमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावतात.
आकृती २ अ मध्ये दर्शविलेल्या कार्यप्रवाहात स्पष्ट केल्याप्रमाणे, नोड्यूल वर्गीकरणासाठी बायोमार्कर हे लीस्ट ॲब्सोल्यूट श्रिंकेज ऑपरेटर्स (least absolute shrinkage operators) वापरून आणि LA (n = 136) व BN (n = 170) मध्ये ओळखल्या गेलेल्या ३३ भिन्न मेटाबोलाइट्सच्या आधारावर निवड करून मिळवले गेले. व्हेरिएबल्सचे सर्वोत्तम संयोजन (LASSO) – बायनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडेल. मॉडेलची विश्वसनीयता तपासण्यासाठी टेन-फोल्ड क्रॉस-व्हॅलिडेशनचा वापर केला गेला. व्हेरिएबल निवड आणि पॅरामीटर रेग्युलरायझेशन हे पॅरामीटर λ24 सह लाइकलीहुड मॅक्झिमायझेशन पेनल्टीद्वारे समायोजित केले जातात. डिस्क्रिमिनांट मॉडेलच्या वर्गीकरण कामगिरीची चाचणी घेण्यासाठी अंतर्गत व्हॅलिडेशन (n = 104) आणि बाह्य व्हॅलिडेशन (n = 111) गटांमध्ये स्वतंत्रपणे ग्लोबल मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण केले गेले. परिणामी, डिस्कव्हरी सेटमधील २७ मेटाबोलाइट्स सर्वात मोठ्या सरासरी AUC मूल्यासह सर्वोत्तम डिस्क्रिमिनांट मॉडेल म्हणून ओळखले गेले (आकृती २ ब), त्यापैकी ९ मेटाबोलाइट्सची क्रियाशीलता BN च्या तुलनेत LA मध्ये वाढलेली होती आणि १८ मेटाबोलाइट्सची क्रियाशीलता कमी झालेली होती (आकृती २ क).
फुफ्फुसीय नोड्यूल वर्गीकरण तयार करण्याची कार्यप्रणाली, ज्यामध्ये दहा-पट क्रॉस-व्हॅलिडेशनद्वारे बायनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडेल वापरून डिस्कव्हरी सेटमधील सीरम मेटाबोलाइट्सचा सर्वोत्तम पॅनेल निवडणे आणि अंतर्गत व बाह्य व्हॅलिडेशन सेटमध्ये भविष्यसूचक कामगिरीचे मूल्यांकन करणे समाविष्ट आहे. b मेटाबोलिक बायोमार्कर निवडीसाठी LASSO रिग्रेशन मॉडेलची क्रॉस-व्हॅलिडेशन सांख्यिकी. वर दिलेले आकडे दिलेल्या λ वर निवडलेल्या बायोमार्कर्सची सरासरी संख्या दर्शवतात. लाल ठिपक्यांची रेषा संबंधित लॅम्डावरील सरासरी AUC मूल्य दर्शवते. राखाडी एरर बार किमान आणि कमाल AUC मूल्ये दर्शवतात. ठिपक्यांची रेषा निवडलेल्या २७ बायोमार्कर्ससह सर्वोत्तम मॉडेल दर्शवते. AUC, रिसीव्हर ऑपरेटिंग कॅरॅक्टरिस्टिक (ROC) वक्राखालील क्षेत्र. c डिस्कव्हरी ग्रुपमधील BN ग्रुपच्या तुलनेत LA ग्रुपमधील निवडलेल्या २७ मेटाबोलाइट्समधील फोल्ड बदल. लाल स्तंभ – सक्रियता. निळा स्तंभ घट दर्शवतो. d–f डिस्कव्हरी, अंतर्गत आणि बाह्य व्हॅलिडेशन सेटमधील २७ मेटाबोलाइट संयोजनांवर आधारित डिस्क्रिमिनांट मॉडेलची शक्ती दर्शवणारे रिसीव्हर ऑपरेटिंग कॅरॅक्टरिस्टिक (ROC) वक्र. स्रोत डेटा सोर्स डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला आहे.
या २७ मेटाबोलाइट्सच्या भारित रिग्रेशन गुणांकांवर आधारित एक प्रेडिक्शन मॉडेल तयार करण्यात आले (पूरक सारणी ३). या २७ मेटाबोलाइट्सवर आधारित ROC विश्लेषणातून एरिया अंडर द कर्व्ह (AUC) मूल्य ०.९३३, डिस्कव्हरी ग्रुप सेन्सिटिव्हिटी ०.८६८ आणि स्पेसिफिसिटी ०.८५९ प्राप्त झाली (आकृती २d). दरम्यान, LA आणि HC मधील ३८ एनोटेटेड डिफरेंशियल मेटाबोलाइट्सपैकी, १६ मेटाबोलाइट्सच्या संचाने LA ला HC पासून वेगळे करण्यात ०.९०२ चा AUC, ०.८०१ ची सेन्सिटिव्हिटी आणि ०.८५६ ची स्पेसिफिसिटी प्राप्त केली (पूरक आकृती ६a-c). डिफरेंशियल मेटाबोलाइट्ससाठी वेगवेगळ्या फोल्ड चेंज थ्रेशोल्डवर आधारित AUC मूल्यांची देखील तुलना करण्यात आली. आम्हाला आढळले की जेव्हा फोल्ड चेंज पातळी १.५ किंवा २.० च्या तुलनेत १.२ वर सेट केली गेली, तेव्हा वर्गीकरण मॉडेलने LA आणि BN (HC) मध्ये फरक करण्यात सर्वोत्तम कामगिरी केली (पूरक आकृती ७a,b). २७ मेटाबोलाइट गटांवर आधारित वर्गीकरण मॉडेलची अंतर्गत आणि बाह्य गटांमध्ये अधिक पडताळणी करण्यात आली. अंतर्गत पडताळणीसाठी AUC ०.९१५ (संवेदनशीलता ०.८६७, विशिष्टता ०.८११) आणि बाह्य पडताळणीसाठी ०.९४५ (संवेदनशीलता ०.८१०, विशिष्टता ०.९७९) होता (आकृती २e, f). आंतरप्रयोगशाळा कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, पद्धती विभागात वर्णन केल्यानुसार बाह्य गटातील ४० नमुन्यांचे बाह्य प्रयोगशाळेत विश्लेषण करण्यात आले. वर्गीकरण अचूकतेने ०.९२५ चा AUC प्राप्त केला (पूरक आकृती ८). फुफ्फुसाचा स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) हा फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमा (LUAD) नंतर नॉन-स्मॉल सेल फुफ्फुस कर्करोगाचा (NSCLC) दुसरा सर्वात सामान्य उपप्रकार असल्याने, आम्ही मेटाबोलिक प्रोफाइलच्या प्रमाणित संभाव्य उपयुक्ततेची देखील चाचणी केली. BN आणि LUSC ची १६ प्रकरणे. LUSC आणि BN मधील भेद करण्याचा AUC 0.776 होता (पूरक आकृती 9), जो LUAD आणि BN मधील भेद करण्याच्या तुलनेत कमी क्षमता दर्शवतो.
अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की सीटी प्रतिमांवरील गाठींचा आकार हा कर्करोगाच्या शक्यतेशी सकारात्मकपणे संबंधित आहे आणि तो गाठींच्या उपचारांचा एक प्रमुख निर्धारक घटक आहे25,26,27. नेल्सन स्क्रीनिंग अभ्यासाच्या मोठ्या गटातील डेटाच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की, 5 मिमी पेक्षा कमी आकाराच्या गाठी असलेल्या व्यक्तींमधील कर्करोगाचा धोका हा गाठी नसलेल्या व्यक्तींमधील धोक्याइतकाच होता28. त्यामुळे, ब्रिटिश थोरॅसिक सोसायटी (BTS) ने शिफारस केल्यानुसार, नियमित सीटी देखरेखीसाठी आवश्यक असलेला किमान आकार 5 मिमी आहे आणि फ्लेश्नर सोसायटीने शिफारस केल्यानुसार 6 मिमी आहे29. तथापि, 6 मिमी पेक्षा मोठ्या आणि स्पष्टपणे सौम्य वैशिष्ट्ये नसलेल्या गाठी, ज्यांना अनिश्चित फुफ्फुसीय गाठी (IPN) म्हणतात, त्यांचे मूल्यांकन आणि व्यवस्थापन करणे हे वैद्यकीय व्यवहारात एक मोठे आव्हान आहे30,31. पुढे, आम्ही डिस्कव्हरी आणि अंतर्गत प्रमाणीकरण गटांमधील एकत्रित नमुने वापरून गाठींच्या आकाराचा मेटाबोलॉमिक सिग्नेचरवर प्रभाव पडतो की नाही हे तपासले. 27 प्रमाणित बायोमार्कर्सवर लक्ष केंद्रित करून, आम्ही प्रथम HC आणि BN च्या 6 मिमी पेक्षा कमी आकाराच्या मेटाबोलॉम्सच्या PCA प्रोफाइलची तुलना केली. आम्हाला आढळले की HC आणि BN साठीचे बहुतेक डेटा पॉइंट्स एकमेकांवर आले, ज्यामुळे हे सिद्ध झाले की दोन्ही गटांमध्ये सीरम मेटाबोलाइटची पातळी समान होती (आकृती 3a). BN आणि LA मध्ये वेगवेगळ्या आकारांच्या श्रेणींमध्ये फीचर मॅप्स समान राहिले (आकृती 3b, c), तर 6-20 मिमी श्रेणीमध्ये घातक आणि सौम्य गाठींमध्ये फरक दिसून आला (आकृती 3d). 6 ते 20 मिमी आकाराच्या गाठींची घातकता वर्तवण्यासाठी या कोहोर्टमध्ये AUC 0.927, विशिष्टता 0.868 आणि संवेदनशीलता 0.820 होती (आकृती 3e, f). आमचे निष्कर्ष दर्शवतात की, गाठीच्या आकाराची पर्वा न करता, हा क्लासिफायर सुरुवातीच्या घातक परिवर्तनामुळे होणारे चयापचय बदल ओळखू शकतो.
ad २७ मेटाबोलाइट्सच्या मेटाबोलिक क्लासिफायरवर आधारित निर्दिष्ट गटांमधील PCA प्रोफाइलची तुलना. CC आणि BN < ६ मिमी. b BN < ६ मिमी विरुद्ध BN ६–२० मिमी. LA ६–२० मिमी विरुद्ध LA २०–३० मिमी मध्ये. g BN ६–२० मिमी आणि LA ६–२० मिमी. GC, n = १७४; BN < ६ मिमी, n = १५३; BN ६–२० मिमी, n = ९१; LA ६–२० मिमी, n = ८९; LA २०–३० मिमी, n = ७७. e ६–२० मिमी नोड्यूलसाठी डिस्क्रिमिनांट मॉडेलची कामगिरी दर्शवणारा रिसीव्हर ऑपरेटिंग कॅरॅक्टरिस्टिक (ROC) वक्र. f ६–२० मिमी मापाच्या नोड्यूलसाठी लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडेलवर आधारित संभाव्यता मूल्ये मोजली गेली. राखाडी ठिपक्यांची रेषा इष्टतम कटऑफ मूल्य (०.४५५) दर्शवते. वरील आकडे लॉस एंजेलिससाठी अंदाजित प्रकरणांची टक्केवारी दर्शवतात. द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी चाचणी वापरा. ​​पीसीए, प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस. एयूसी, एरिया अंडर द कर्व्ह. स्रोत डेटा सोर्स डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला आहे.
प्रस्तावित घातकतेच्या अंदाजाच्या मॉडेलची कार्यक्षमता स्पष्ट करण्यासाठी, फुफ्फुसातील गाठींचा आकार सारखा (७-९ मिमी) असलेले चार नमुने (वय ४४-६१ वर्षे) पुढे निवडण्यात आले (आकृती ४अ, ब). प्राथमिक तपासणीत, केस १ मध्ये कॅल्सीफिकेशन असलेली एक घन गाठ आढळली, जे सौम्यतेशी संबंधित वैशिष्ट्य आहे, तर केस २ मध्ये कोणतीही स्पष्ट सौम्य वैशिष्ट्ये नसलेली एक अनिश्चित, अंशतः घन गाठ आढळली. पाठपुराव्यासाठी केलेल्या सीटी स्कॅनच्या तीन फेऱ्यांमध्ये असे दिसून आले की, ही प्रकरणे ४ वर्षांच्या कालावधीत स्थिर राहिली आणि म्हणूनच त्यांना सौम्य गाठी मानले गेले (आकृती ४अ). सलग सीटी स्कॅनच्या क्लिनिकल मूल्यांकनाच्या तुलनेत, सध्याच्या क्लासिफायर मॉडेलसह केलेल्या सिंगल-शॉट सीरम मेटाबोलाइट विश्लेषणाने संभाव्य मर्यादांच्या आधारावर या सौम्य गाठी जलद आणि अचूकपणे ओळखल्या (तक्ता १). केस ३ मधील आकृती ४ब मध्ये प्लुरल रिट्रॅक्शनची चिन्हे असलेली एक गाठ दर्शविली आहे, जी बहुतेकदा घातकतेशी संबंधित असते³². केस ४ मध्ये सौम्य कारणाचा कोणताही पुरावा नसलेली एक अनिश्चित, अंशतः घन गाठ आढळली. क्लासिफायर मॉडेलनुसार या सर्व केसेस घातक म्हणून भाकीत करण्यात आल्या होत्या (तक्ता १). फुफ्फुस काढून टाकण्याच्या शस्त्रक्रियेनंतर हिस्टोपॅथॉलॉजिकल तपासणीद्वारे फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाचे मूल्यांकन सिद्ध झाले (आकृती ४ब). बाह्य प्रमाणीकरण संचासाठी, मेटाबोलिक क्लासिफायरने ६ मिमी पेक्षा मोठ्या असलेल्या अनिश्चित फुफ्फुसाच्या गाठींच्या दोन केसेसचे अचूक भाकीत केले (पूरक आकृती १०).
सौम्य गाठींच्या दोन प्रकरणांमधील फुफ्फुसांच्या ॲक्सियल विंडोच्या सीटी प्रतिमा. प्रकरण १ मध्ये, ४ वर्षांनंतर केलेल्या सीटी स्कॅनमध्ये उजव्या खालच्या लोबमध्ये कॅल्सीफिकेशनसह ७ मिमी मापाची एक स्थिर, घन गाठ दिसून आली. प्रकरण २ मध्ये, ५ वर्षांनंतर केलेल्या सीटी स्कॅनमध्ये उजव्या वरच्या लोबमध्ये ७ मिमी व्यासाची एक स्थिर, अंशतः घन गाठ दिसून आली. ब) फुफ्फुसांच्या शस्त्रक्रियेपूर्वी स्टेज I ॲडेनोकार्सिनोमाच्या दोन प्रकरणांमधील फुफ्फुसांच्या ॲक्सियल विंडो सीटी प्रतिमा आणि संबंधित पॅथॉलॉजिकल अभ्यास. प्रकरण ३ मध्ये उजव्या वरच्या लोबमध्ये प्लुरल रिट्रॅक्शनसह ८ मिमी व्यासाची एक गाठ दिसून आली. प्रकरण ४ मध्ये डाव्या वरच्या लोबमध्ये ९ मिमी मापाची अंशतः घन ग्राउंड-ग्लास गाठ दिसून आली. शस्त्रक्रियेने काढलेल्या फुफ्फुसाच्या ऊतींचे हेमॅटॉक्सिलिन आणि इओसिन (H&E) स्टेनिंग (स्केल बार = ५० μm) फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाची ॲसिनार वाढीची पद्धत दर्शवते. बाण सीटी प्रतिमांवर आढळलेल्या गाठी दर्शवतात. H&E प्रतिमा ह्या पॅथॉलॉजिस्टने तपासलेल्या अनेक (>3) सूक्ष्मदर्शी क्षेत्रांच्या प्रातिनिधिक प्रतिमा आहेत.
एकंदरीत, आमचे निष्कर्ष फुफ्फुसातील गाठींच्या विभेदक निदानामध्ये सीरम मेटाबोलाइट बायोमार्कर्सचे संभाव्य मूल्य दर्शवतात, जे सीटी स्क्रीनिंगचे मूल्यांकन करताना आव्हाने निर्माण करू शकतात.
प्रमाणित विभेदक मेटाबोलाइट पॅनेलच्या आधारे, आम्ही प्रमुख चयापचय बदलांचे जैविक सहसंबंध ओळखण्याचा प्रयत्न केला. मेटाबोॲनालिस्टद्वारे केलेल्या KEGG पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषणाने दिलेल्या दोन गटांमध्ये (LA विरुद्ध HC आणि LA विरुद्ध BN, समायोजित p ≤ 0.001, परिणाम > 0.01) 6 सामान्य लक्षणीयरीत्या बदललेले पाथवे ओळखले. हे बदल पायरुवेट चयापचय, ट्रिप्टोफॅन चयापचय, नियासिन आणि निकोटिनामाइड चयापचय, ग्लायकोलिसिस, TCA चक्र आणि प्युरिन चयापचय यांमधील बिघाडांद्वारे वैशिष्ट्यीकृत होते (आकृती 5a). त्यानंतर आम्ही परिपूर्ण प्रमाणीकरण वापरून प्रमुख बदलांची पडताळणी करण्यासाठी लक्ष्यित मेटाबोलॉमिक्स केले. अस्सल मेटाबोलाइट मानकांचा वापर करून ट्रिपल क्वॉड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (QQQ) द्वारे सामान्यतः बदललेल्या पाथवेमधील सामान्य मेटाबोलाइट्सचे निर्धारण केले. मेटाबोलॉमिक्स अभ्यासाच्या लक्ष्य नमुन्याची लोकसंख्याशास्त्रीय वैशिष्ट्ये परिशिष्ट सारणी ४ मध्ये समाविष्ट आहेत. आमच्या जागतिक मेटाबोलॉमिक्स निष्कर्षांशी सुसंगत, परिमाणात्मक विश्लेषणाने पुष्टी केली की बीएन आणि एचसीच्या तुलनेत एलए मध्ये हायपोझॅन्थिन आणि झॅन्थिन, पायरुवेट आणि लॅक्टेट वाढले होते (आकृती ५ब, क, p <०.०५). तथापि, बीएन आणि एचसीमध्ये या मेटाबोलाइट्समध्ये कोणतेही लक्षणीय फरक आढळले नाहीत.
BN आणि HC गटांच्या तुलनेत LA गटामध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेल्या मेटाबोलाइट्सचे KEGG पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषण. यासाठी द्विपक्षीय ग्लोबलटेस्टचा वापर करण्यात आला आणि p मूल्यांना होल्म-बोनफेरोनी पद्धतीचा वापर करून समायोजित करण्यात आले (समायोजित p ≤ 0.001 आणि इफेक्ट साईज > 0.01). b–d व्हायोलिन प्लॉट्स जे LC-MS/MS द्वारे निर्धारित केलेल्या सीरम HC, BN, आणि LA मधील हायपोझॅन्थिन, झॅन्थिन, लॅक्टेट, पायरुवेट आणि ट्रिप्टोफॅनची पातळी दर्शवतात (प्रत्येक गटात n = 70). पांढऱ्या आणि काळ्या ठिपक्यांच्या रेषा अनुक्रमे मध्यक आणि चतुर्थक दर्शवतात. e व्हायोलिन प्लॉट जो LUAD-TCGA डेटासेटमधील सामान्य फुफ्फुसाच्या ऊतींच्या (n = 59) तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमामध्ये (n = 513) SLC7A5 आणि QPRT ची सामान्यीकृत Log2TPM (ट्रान्सक्रिप्ट्स प्रति दशलक्ष) mRNA अभिव्यक्ती दर्शवतो. पांढरा बॉक्स इंटरक्वार्टाइल रेंज दर्शवतो, मध्यभागी असलेली आडवी काळी रेषा मीडियन दर्शवते आणि बॉक्समधून बाहेर पडणारी उभी काळी रेषा ९५% कॉन्फिडन्स इंटरव्हल (CI) दर्शवते. f TCGA डेटासेटमधील फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमा (n = 513) आणि सामान्य फुफ्फुसाच्या ऊतींमधील (n = 59) SLC7A5 आणि GAPDH अभिव्यक्तीचा पिअरसन कोरिलेशन प्लॉट. राखाडी भाग ९५% CI दर्शवतो. r, पिअरसन कोरिलेशन कोएफिशिएंट. g LC-MS/MS द्वारे निर्धारित, नॉन-स्पेसिफिक shRNA कंट्रोल (NC) आणि shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ने ट्रान्सफेक्ट केलेल्या A549 पेशींमधील नॉर्मलाइज्ड सेल्युलर ट्रिप्टोफॅनची पातळी. प्रत्येक गटातील पाच जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र नमुन्यांचे सांख्यिकीय विश्लेषण सादर केले आहे. h A549 पेशी (NC) आणि SLC7A5 नॉकडाउन A549 पेशी (Sh1, Sh2) मधील NADt (एकूण NAD, ज्यामध्ये NAD+ आणि NADH समाविष्ट आहेत) ची सेल्युलर पातळी. प्रत्येक गटातील तीन जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र नमुन्यांचे सांख्यिकीय विश्लेषण सादर केले आहे. SLC7A5 नॉकडाउनच्या आधी आणि नंतर A549 पेशींची ग्लायकोलिटिक क्रियाशीलता एक्स्ट्रासेल्युलर ॲसिडिफिकेशन रेट (ECAR) द्वारे मोजण्यात आली (प्रत्येक गटात n = ४ जैविकदृष्ट्या स्वतंत्र नमुने). २-डीजी, २-डीऑक्सी-डी-ग्लुकोज. (b–h) मध्ये द्विपक्षीय स्टुडंट्स टी चाचणी वापरण्यात आली. (g–i) मध्ये, एरर बार सरासरी ± SD दर्शवतात, प्रत्येक प्रयोग तीन वेळा स्वतंत्रपणे करण्यात आला आणि त्याचे परिणाम सारखेच होते. मूळ डेटा सोर्स डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला आहे.
LA गटामध्ये बदललेल्या ट्रिप्टोफॅन चयापचयाचा महत्त्वपूर्ण परिणाम लक्षात घेऊन, आम्ही QQQ वापरून HC, BN आणि LA गटांमधील सीरम ट्रिप्टोफॅन पातळीचे देखील मूल्यांकन केले. आम्हाला आढळले की HC किंवा BN च्या तुलनेत LA मध्ये सीरम ट्रिप्टोफॅन कमी झाले होते (p < 0.001, आकृती 5d), जे नियंत्रण गटातील निरोगी व्यक्तींच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या रुग्णांमध्ये रक्तातील ट्रिप्टोफॅनची पातळी कमी असते या पूर्वीच्या निष्कर्षांशी सुसंगत आहे33,34,35. PET/CT ट्रेसर 11C-मिथाइल-एल-ट्रिप्टोफॅन वापरून केलेल्या आणखी एका अभ्यासात असे आढळले की सौम्य जखमा किंवा सामान्य ऊतींच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या ऊतींमध्ये ट्रिप्टोफॅन सिग्नल टिकून राहण्याचा कालावधी लक्षणीयरीत्या वाढला होता36. आमचा असा अंदाज आहे की LA सीरममधील ट्रिप्टोफॅनची घट ही फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या पेशींद्वारे सक्रिय ट्रिप्टोफॅन शोषणाचे प्रतिबिंब असू शकते.
हे देखील ज्ञात आहे की ट्रिप्टोफॅन कॅटाबोलिझमच्या किन्युरेनाइन मार्गाचे अंतिम उत्पादन NAD+37,38 आहे, जे ग्लायकोलिसिसमध्ये ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेटची 1,3-बिस्फॉस्फोग्लिसरेटसोबतच्या प्रतिक्रियेसाठी एक महत्त्वाचे सब्सट्रेट आहे39. मागील अभ्यासांनी रोगप्रतिकारक शक्तीच्या नियमनामध्ये ट्रिप्टोफॅन कॅटाबोलिझमच्या भूमिकेवर लक्ष केंद्रित केले असले तरी, आम्ही सध्याच्या अभ्यासात आढळलेल्या ट्रिप्टोफॅनच्या अनियमित नियमन आणि ग्लायकोलिटिक मार्गांमधील परस्परसंबंध स्पष्ट करण्याचा प्रयत्न केला. सोल्युट ट्रान्सपोर्टर फॅमिली 7 मेंबर 5 (SLC7A5) हा एक ट्रिप्टोफॅन ट्रान्सपोर्टर म्हणून ओळखला जातो43,44,45. क्विनोलिनिक ॲसिड फॉस्फोराइबोसिलट्रान्सफरेज (QPRT) हे किन्युरेनाइन मार्गाच्या खालील बाजूस असलेले एक एन्झाइम आहे जे क्विनोलिनिक ॲसिडचे NAMN मध्ये रूपांतर करते46. LUAD TCGA डेटासेटच्या तपासणीत असे दिसून आले की सामान्य ऊतींच्या तुलनेत ट्यूमर ऊतींमध्ये SLC7A5 आणि QPRT दोन्ही लक्षणीयरीत्या वाढलेले होते (आकृती 5e). फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या पहिल्या आणि दुसऱ्या टप्प्यात तसेच तिसऱ्या आणि चौथ्या टप्प्यात ही वाढ दिसून आली (पूरक आकृती 11), जी ट्यूमर निर्मितीशी संबंधित ट्रिप्टोफॅन चयापचयातील सुरुवातीच्या टप्प्यातील बिघाड दर्शवते.
याव्यतिरिक्त, LUAD-TCGA डेटासेटमध्ये कर्करोगाच्या रुग्णांच्या नमुन्यांमध्ये SLC7A5 आणि GAPDH mRNA अभिव्यक्तीमध्ये सकारात्मक सहसंबंध दिसून आला (r = 0.45, p = 1.55E-26, आकृती 5f). याउलट, सामान्य फुफ्फुसाच्या ऊतींमध्ये अशा जीन सिग्नेचरमध्ये कोणताही महत्त्वपूर्ण सहसंबंध आढळला नाही (r = 0.25, p = 0.06, आकृती 5f). A549 पेशींमध्ये SLC7A5 चे नॉकडाऊन केल्याने (पूरक आकृती 12) पेशींमधील ट्रिप्टोफॅन आणि NAD(H) ची पातळी लक्षणीयरीत्या कमी झाली (आकृती 5g,h), ज्यामुळे बाह्यपेशीय आम्लीकरण दराने (ECAR) मोजल्याप्रमाणे ग्लायकोलिटिक क्रिया मंदावली (आकृती 1.5i). अशाप्रकारे, सीरममधील चयापचय बदल आणि इन विट्रो तपासणीच्या आधारावर, आम्ही असा अंदाज लावतो की ट्रिप्टोफॅन चयापचय किन्युरेनाइन मार्गाद्वारे NAD+ तयार करू शकतो आणि फुफ्फुसाच्या कर्करोगात ग्लायकोलिसिसला चालना देण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावू शकतो.
अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की LDCT द्वारे आढळलेल्या मोठ्या संख्येने अनिश्चित फुफ्फुसीय नोड्यूलमुळे घातकतेच्या चुकीच्या-सकारात्मक निदानामुळे PET-CT, फुफ्फुस बायोप्सी यांसारख्या अतिरिक्त चाचण्या आणि अतिरिक्त उपचारांची आवश्यकता भासू शकते.31 आकृती 6 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, आमच्या अभ्यासात संभाव्य निदानात्मक मूल्य असलेल्या सीरम मेटाबोलाइट्सचा एक पॅनेल ओळखला गेला आहे जो CT द्वारे आढळलेल्या फुफ्फुसीय नोड्यूलचे जोखीम वर्गीकरण आणि त्यानंतरचे व्यवस्थापन सुधारू शकतो.
फुफ्फुसातील गाठींचे मूल्यांकन कमी-डोस संगणकीय टोमोग्राफी (LDCT) वापरून केले जाते, ज्यामध्ये सौम्य किंवा घातक कारणांचे सूचक इमेजिंग वैशिष्ट्ये असतात. गाठींच्या अनिश्चित परिणामामुळे वारंवार पाठपुरावा भेटी, अनावश्यक हस्तक्षेप आणि अतिरिक्त उपचार होऊ शकतात. निदानात्मक मूल्य असलेल्या सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायर्सचा समावेश केल्याने फुफ्फुसातील गाठींचे जोखीम मूल्यांकन आणि त्यानंतरचे व्यवस्थापन सुधारू शकते. पीईटी (PET) पॉझिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी.
अमेरिकेतील NLST अभ्यास आणि युरोपमधील NELSON अभ्यासातील डेटा असे सूचित करतो की, कमी-डोस कम्प्युटेड टोमोग्राफी (LDCT) द्वारे उच्च-जोखीम गटांची तपासणी केल्यास फुफ्फुसाच्या कर्करोगामुळे होणारे मृत्यू कमी होऊ शकतात¹,³. तथापि, LDCT द्वारे आढळलेल्या मोठ्या संख्येने आकस्मिक फुफ्फुसीय गाठींचे जोखीम मूल्यांकन आणि त्यानंतरचे वैद्यकीय व्यवस्थापन हे सर्वात आव्हानात्मक आहे. विश्वसनीय बायोमार्कर्सचा समावेश करून सध्याच्या LDCT-आधारित प्रोटोकॉलचे अचूक वर्गीकरण अधिक प्रभावी करणे हे मुख्य उद्दिष्ट आहे.
निरोगी व्यक्तींच्या तुलनेत फुफ्फुसांच्या कर्करोगाची तुलना करून, रक्तातील मेटाबोलाइट्ससारखे काही आण्विक बायोमार्कर ओळखले गेले आहेत¹⁵,¹⁷. सध्याच्या अभ्यासात, आम्ही LDCT द्वारे योगायोगाने आढळलेल्या सौम्य आणि घातक फुफ्फुसीय नोड्यूल्समध्ये फरक करण्यासाठी सीरम मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषणाच्या उपयोगावर लक्ष केंद्रित केले. आम्ही UPLC-HRMS विश्लेषणाचा वापर करून निरोगी व्यक्ती (HC), सौम्य फुफ्फुसीय नोड्यूल्स (BN), आणि स्टेज I फुफ्फुसीय ॲडेनोकार्सिनोमा (LA) नमुन्यांच्या संपूर्ण सीरम मेटाबोलॉमची तुलना केली. आम्हाला आढळले की HC आणि BN यांचे मेटाबोलिक प्रोफाइल समान होते, तर LA मध्ये HC आणि BN च्या तुलनेत लक्षणीय बदल दिसून आले. आम्ही सीरम मेटाबोलाइट्सचे दोन संच ओळखले जे LA ​​ला HC आणि BN पासून वेगळे करतात.
सौम्य आणि घातक गाठी ओळखण्याची सध्याची LDCT-आधारित योजना प्रामुख्याने गाठींचा आकार, घनता, आकारविज्ञान आणि कालांतराने वाढीचा दर यावर आधारित आहे30. मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की गाठींचा आकार फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या शक्यतेशी जवळून संबंधित आहे. उच्च-जोखीम असलेल्या रुग्णांमध्येही, <6 मिमी आकाराच्या गाठींमध्ये घातकतेचा धोका <1% असतो. 6 ते 20 मिमी आकाराच्या गाठींमध्ये घातकतेचा धोका 8% ते 64% पर्यंत असतो30. त्यामुळे, फ्लेश्नर सोसायटी नियमित CT फॉलो-अपसाठी 6 मिमी व्यासाची शिफारस करते. 29 तथापि, 6 मिमी पेक्षा मोठ्या अनिश्चित फुफ्फुसीय गाठींचे (IPN) जोखीम मूल्यांकन आणि व्यवस्थापन पुरेसे केले गेले नाही31. जन्मजात हृदयरोगाचे सध्याचे व्यवस्थापन सामान्यतः वारंवार CT देखरेखीसह 'वॉचफुल वेटिंग'वर आधारित आहे.
प्रमाणित मेटाबोलॉमच्या आधारे, आम्ही निरोगी व्यक्ती आणि <6 मिमी आकाराच्या सौम्य गाठी यांच्यातील मेटाबोलॉमिक सिग्नेचरमधील साम्य प्रथमच दाखवून दिले. हे जैविक साम्य पूर्वीच्या सीटी निष्कर्षांशी सुसंगत आहे, ज्यानुसार <6 मिमी आकाराच्या गाठींमध्ये कर्करोगाचा धोका हा गाठी नसलेल्या व्यक्तींइतकाच कमी असतो.30 हे लक्षात घ्यावे की आमचे निष्कर्ष हे देखील दर्शवतात की <6 मिमी आणि ≥6 मिमी आकाराच्या सौम्य गाठींच्या मेटाबोलॉमिक प्रोफाइलमध्ये उच्च साम्य आहे, जे सूचित करते की सौम्य कारणाची कार्यात्मक व्याख्या गाठीच्या आकाराची पर्वा न करता सुसंगत आहे. अशाप्रकारे, जेव्हा सीटीवर सुरुवातीला गाठी आढळतात, तेव्हा आधुनिक निदानात्मक सीरम मेटाबोलाइट पॅनेल हे कर्करोग नाही हे निश्चित करण्यासाठी एकच चाचणी म्हणून वापरले जाऊ शकतात आणि संभाव्यतः वारंवार होणारे निरीक्षण कमी करू शकतात. त्याच वेळी, मेटाबोलिक बायोमार्कर्सच्या त्याच पॅनेलने ≥6 मिमी आकाराच्या कर्करोगाच्या गाठींना सौम्य गाठींपासून वेगळे केले आणि सीटी प्रतिमांवर समान आकाराच्या आणि अस्पष्ट आकारशास्त्रीय वैशिष्ट्ये असलेल्या आयपीएनसाठी अचूक अंदाज प्रदान केले. या सीरम मेटाबॉलिझम क्लासिफायरने ≥६ मिमी आकाराच्या गाठींची घातकता वर्तवण्यात ०.९२७ च्या AUC सह चांगली कामगिरी केली. एकंदरीत, आमचे निष्कर्ष असे सूचित करतात की, विशिष्ट सीरम मेटाबोलॉमिक सिग्नेचर हे गाठीच्या आकारापासून स्वतंत्रपणे, ट्यूमरमुळे होणाऱ्या सुरुवातीच्या चयापचय बदलांना विशेषतः प्रतिबिंबित करू शकतात आणि धोक्याचे सूचक म्हणून त्यांचे संभाव्य मूल्य आहे.
विशेषतः, फुफ्फुसाचा ॲडेनोकार्सिनोमा (LUAD) आणि स्क्वॅमस सेल कार्सिनोमा (LUSC) हे नॉन-स्मॉल सेल फुफ्फुस कर्करोगाचे (NSCLC) मुख्य प्रकार आहेत. LUSC चा तंबाखू सेवनाशी घनिष्ठ संबंध आहे⁴⁷ आणि सीटी स्क्रिनिंगमध्ये आढळणाऱ्या फुफ्फुसातील गाठींमध्ये LUAD हा सर्वात सामान्य हिस्टोलॉजी प्रकार आहे⁴⁸, हे लक्षात घेता, आमचे क्लासिफायर मॉडेल विशेषतः स्टेज I ॲडेनोकार्सिनोमाच्या नमुन्यांसाठी तयार केले गेले होते. वांग आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांनी देखील LUAD वर लक्ष केंद्रित केले आणि निरोगी व्यक्तींपासून फुफ्फुसाचा कर्करोग सुरुवातीच्या टप्प्यात ओळखण्यासाठी लिपिडोमिक्सचा वापर करून नऊ लिपिड सिग्नेचर ओळखले¹⁷. आम्ही सध्याच्या क्लासिफायर मॉडेलची चाचणी स्टेज I LUSC च्या १६ केसेस आणि ७४ सौम्य गाठींवर केली आणि LUSC च्या अंदाजाची कमी अचूकता (AUC 0.776) पाहिली, ज्यामुळे असे सूचित होते की LUAD आणि LUSC चे स्वतःचे मेटाबोलॉमिक सिग्नेचर असू शकतात. खरे तर, LUAD आणि LUSC हे एटिओलॉजी, जैविक मूळ आणि अनुवांशिक विकृतींमध्ये भिन्न असल्याचे दिसून आले आहे⁴⁹. त्यामुळे, स्क्रीनिंग कार्यक्रमांमध्ये लोकसंख्येवर आधारित फुफ्फुसाच्या कर्करोगाचे निदान करण्यासाठी मॉडेलना प्रशिक्षण देताना इतर प्रकारच्या हिस्टोलॉजीचा समावेश केला पाहिजे.
येथे, आम्ही निरोगी नियंत्रक आणि सौम्य गाठींच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमामध्ये सर्वाधिक वेळा बदललेले सहा मार्ग ओळखले. झॅन्थिन आणि हायपोझॅन्थिन हे प्युरिन चयापचय मार्गाचे सामान्य मेटाबोलाइट्स आहेत. आमच्या निष्कर्षांशी सुसंगतपणे, निरोगी नियंत्रक किंवा पूर्व-आक्रमक अवस्थेतील रुग्णांच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या रुग्णांच्या सीरम किंवा ऊतींमध्ये प्युरिन चयापचयाशी संबंधित मध्यस्थ लक्षणीयरीत्या वाढलेले आढळले¹⁵,⁵⁰. वाढलेली सीरम झॅन्थिन आणि हायपोझॅन्थिनची पातळी वेगाने वाढणाऱ्या कर्करोगाच्या पेशींसाठी आवश्यक असलेल्या ॲनाबॉलिझमला प्रतिबिंबित करू शकते. ग्लुकोज चयापचयातील बिघाड हे कर्करोगाच्या चयापचयाचे एक सुप्रसिद्ध वैशिष्ट्य आहे⁵¹. येथे, आम्ही HC आणि BN गटाच्या तुलनेत LA गटामध्ये पायरुवेट आणि लॅक्टेटमध्ये लक्षणीय वाढ पाहिली, जी नॉन-स्मॉल सेल लंग कॅन्सर (NSCLC) रुग्णांच्या आणि निरोगी नियंत्रकांच्या सीरम मेटाबोलॉम प्रोफाइलमधील ग्लायकोलाइटिक मार्गाच्या असामान्यतेच्या पूर्वीच्या अहवालांशी सुसंगत आहे. निष्कर्ष सुसंगत आहेत⁵²,⁵³.
महत्त्वाची गोष्ट म्हणजे, आम्हाला फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या सीरममध्ये पायरुवेट आणि ट्रिप्टोफॅन चयापचय यांच्यात व्यस्त सहसंबंध आढळला. एचसी किंवा बीएन गटाच्या तुलनेत एलए गटामध्ये सीरम ट्रिप्टोफॅनची पातळी कमी झाली होती. विशेष म्हणजे, एका प्रॉस्पेक्टिव्ह कोहोर्टचा वापर करून केलेल्या पूर्वीच्या एका मोठ्या अभ्यासात असे आढळून आले की रक्ताभिसरणातील ट्रिप्टोफॅनची कमी पातळी फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या वाढत्या धोक्याशी संबंधित होती ५४. ट्रिप्टोफॅन हे एक अत्यावश्यक अमिनो ॲसिड आहे जे आपल्याला पूर्णपणे अन्नातून मिळते. आम्ही असा निष्कर्ष काढतो की फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमामध्ये सीरम ट्रिप्टोफॅनची घट या मेटाबोलाइटच्या जलद क्षयाला प्रतिबिंबित करू शकते. हे सर्वज्ञात आहे की किन्युरेनाइन मार्गाद्वारे ट्रिप्टोफॅनच्या कॅटाबोलिझमचे अंतिम उत्पादन हे डी नोव्हो NAD+ संश्लेषणाचा स्रोत आहे. कारण NAD+ प्रामुख्याने साल्वेज मार्गाद्वारे तयार होते, त्यामुळे आरोग्य आणि आजारपणात ट्रिप्टोफॅन चयापचयामध्ये NAD+ चे महत्त्व अद्याप निश्चित करणे बाकी आहे४६. TCGA डेटाबेसच्या आमच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की, सामान्य नियंत्रणांच्या तुलनेत फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमामध्ये ट्रिप्टोफॅन ट्रान्सपोर्टर सॉल्यूट ट्रान्सपोर्टर 7A5 (SLC7A5) ची अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या वाढली होती आणि तिचा ग्लायकोलिटिक एन्झाइम GAPDH च्या अभिव्यक्तीशी सकारात्मक सहसंबंध होता. मागील अभ्यासांनी मुख्यत्वे अँटीट्यूमर इम्युन रिस्पॉन्स दाबण्यात ट्रिप्टोफॅन कॅटाबोलिझमच्या भूमिकेवर लक्ष केंद्रित केले आहे40,41,42. येथे आम्ही दाखवतो की फुफ्फुसाच्या कर्करोगाच्या पेशींमध्ये SLC7A5 चे नॉकडाऊन करून ट्रिप्टोफॅनचे ग्रहण रोखल्यास, परिणामी पेशींमधील NAD पातळीत घट होते आणि त्याचबरोबर ग्लायकोलिटिक क्रियाकलाप मंदावतो. सारांश, आमचा अभ्यास फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाच्या घातक परिवर्तनाशी संबंधित सीरम चयापचयातील बदलांसाठी एक जैविक आधार प्रदान करतो.
NSCLC असलेल्या रुग्णांमध्ये EGFR उत्परिवर्तन हे सर्वात सामान्य चालक उत्परिवर्तन आहे. आमच्या अभ्यासात, आम्हाला आढळले की EGFR उत्परिवर्तन असलेल्या रुग्णांचे (n = 41) एकूण मेटाबोलॉमिक प्रोफाइल वाइल्ड-टाइप EGFR असलेल्या रुग्णांसारखेच (n = 31) होते, जरी आम्हाला काही EGFR उत्परिवर्तित रुग्णांमध्ये एसिलकार्निटाइनची सीरम पातळी कमी झालेली आढळली. एसिलकार्निटाइनचे स्थापित कार्य म्हणजे एसिल गटांना सायटोप्लाझममधून मायटोकॉन्ड्रियल मॅट्रिक्समध्ये वाहून नेणे, ज्यामुळे ऊर्जा निर्माण करण्यासाठी फॅटी ऍसिडचे ऑक्सिडेशन होते ५५. आमच्या निष्कर्षांशी सुसंगत, एका अलीकडील अभ्यासात १०२ फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमा ऊतींच्या नमुन्यांच्या जागतिक मेटाबोलॉमचे विश्लेषण करून EGFR उत्परिवर्तित आणि EGFR वाइल्ड-टाइप ट्यूमरमध्ये समान मेटाबोलॉम प्रोफाइल ओळखले गेले ५०. विशेष म्हणजे, EGFR उत्परिवर्तित गटामध्ये देखील एसिलकार्निटाइनचे प्रमाण आढळले. म्हणून, एसिलकार्निटाइनच्या पातळीतील बदल हे EGFR-प्रेरित चयापचय बदल आणि त्यामागील आण्विक मार्गांना प्रतिबिंबित करतात की नाही, याचा पुढील अभ्यास करणे आवश्यक आहे.
सारांशतः, आमचा अभ्यास फुफ्फुसातील गाठींच्या विभेदक निदानासाठी एक सीरम मेटाबोलिक क्लासिफायर स्थापित करतो आणि सीटी स्कॅन स्क्रीनिंगवर आधारित जोखीम मूल्यांकन ऑप्टिमाइझ करू शकणारी व क्लिनिकल व्यवस्थापन सुलभ करू शकणारी एक कार्यप्रणाली प्रस्तावित करतो.
या अभ्यासाला सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर हॉस्पिटल, सन यट-सेन युनिव्हर्सिटीचे पहिले संलग्न रुग्णालय आणि झेंगझोऊ युनिव्हर्सिटी कॅन्सर हॉस्पिटलच्या नीती समितीने मान्यता दिली होती. शोध आणि अंतर्गत प्रमाणीकरण गटांमध्ये, सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरच्या कर्करोग नियंत्रण आणि प्रतिबंध विभागात वार्षिक वैद्यकीय तपासणी करणाऱ्या व्यक्तींकडून निरोगी व्यक्तींचे १७४ सीरम आणि सौम्य गाठींचे २४४ सीरम गोळा करण्यात आले, आणि सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरमधून स्टेज I फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाचे १६६ सौम्य गाठींचे सीरम गोळा करण्यात आले. बाह्य प्रमाणीकरण गटात, सन यट-सेन युनिव्हर्सिटीच्या पहिल्या संलग्न रुग्णालयातील सौम्य गाठींची ४८ प्रकरणे, स्टेज I फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाची ३९ प्रकरणे आणि झेंगझोऊ कॅन्सर हॉस्पिटलमधील स्टेज I फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाची २४ प्रकरणे होती. सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरने स्थापित मेटाबोलिक क्लासिफायरच्या निदान क्षमतेची चाचणी घेण्यासाठी स्टेज I स्क्वॅमस सेल फुफ्फुस कर्करोगाची १६ प्रकरणे देखील गोळा केली (रुग्णांची वैशिष्ट्ये परिशिष्ट सारणी ५ मध्ये दर्शविली आहेत). डिस्कव्हरी कोहोर्ट आणि अंतर्गत व्हॅलिडेशन कोहोर्टमधील नमुने जानेवारी २०१८ ते मे २०२० दरम्यान गोळा केले गेले. बाह्य व्हॅलिडेशन कोहोर्टसाठी नमुने ऑगस्ट २०२१ ते ऑक्टोबर २०२२ दरम्यान गोळा केले गेले. लिंगभेद कमी करण्यासाठी, प्रत्येक कोहोर्टमध्ये अंदाजे समान संख्येने पुरुष आणि महिला प्रकरणे समाविष्ट केली गेली. डिस्कव्हरी टीम आणि अंतर्गत पुनरावलोकन टीम. सहभागींचे लिंग स्व-अहवालाच्या आधारे निश्चित केले गेले. सर्व सहभागींकडून माहितीपूर्ण संमती घेण्यात आली आणि कोणतेही मानधन दिले गेले नाही. विश्लेषणाच्या वेळी २ ते ५ वर्षांपर्यंत ज्यांचा सीटी स्कॅन स्कोअर स्थिर होता, अशा रुग्णांना सौम्य गाठी असलेले मानले गेले, बाह्य व्हॅलिडेशन नमुन्यातील एका प्रकरणाचा अपवाद वगळता, जे शस्त्रक्रियेपूर्वी गोळा केले गेले होते आणि हिस्टोपॅथॉलॉजीद्वारे निदान केले गेले होते. क्रॉनिक ब्राँकायटिसचा अपवाद वगळता. फुफ्फुसाच्या ॲडेनोकार्सिनोमाची प्रकरणे फुफ्फुस रिसेक्शनपूर्वी गोळा केली गेली आणि पॅथॉलॉजिकल निदानाने पुष्टी केली गेली. उपाशीपोटी रक्ताचे नमुने कोणत्याही अँटीकोएग्युलंटशिवाय सीरम सेपरेशन ट्यूबमध्ये गोळा करण्यात आले. रक्ताचे नमुने खोलीच्या तापमानावर १ तास गोठवण्यात आले आणि नंतर सीरम सुपरनॅटंट गोळा करण्यासाठी ४°C तापमानावर १० मिनिटांसाठी २८५१ × g वर सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले. मेटाबोलाइट निष्कर्षण होईपर्यंत सीरमचे भाग -८०°C तापमानावर गोठवण्यात आले. सन यट-सेन युनिव्हर्सिटी कॅन्सर सेंटरच्या कर्करोग प्रतिबंध आणि वैद्यकीय तपासणी विभागाने १०० निरोगी दात्यांकडून सीरमचा एक पूल गोळा केला, ज्यात ४० ते ५५ वर्षे वयोगटातील पुरुष आणि महिलांची समान संख्या होती. प्रत्येक दात्याच्या नमुन्याचे समान प्रमाण मिसळण्यात आले, परिणामी तयार झालेल्या पूलचे भाग पाडण्यात आले आणि ते -८०°C तापमानावर साठवण्यात आले. सीरम मिश्रणाचा वापर गुणवत्ता नियंत्रण आणि डेटा मानकीकरणासाठी संदर्भ सामग्री म्हणून करण्यात आला.
संदर्भ सीरम आणि चाचणी नमुने वितळवून, संयुक्त निष्कर्षण पद्धत (MTBE/मिथेनॉल/पाणी) ५६ वापरून मेटाबोलाइट्स काढण्यात आले. थोडक्यात, ५० ​​μl सीरममध्ये २२५ μl बर्फासारखे थंड मिथेनॉल आणि ७५० μl बर्फासारखे थंड मिथाइल टर्ट-ब्युटाइल इथर (MTBE) मिसळण्यात आले. मिश्रण ढवळून १ तास बर्फावर ठेवण्यात आले. त्यानंतर, अंतर्गत मानके (१३C-लॅक्टेट, १३C३-पायरूव्हेट, १३C-मेथिओनिन, आणि १३C६-आयसोलेउसीन, केंब्रिज आयसोटोप लॅबोरेटरीजकडून खरेदी केलेले) असलेल्या १८८ μl MS-ग्रेड पाण्यासोबत नमुने मिसळून व्हॉर्टेक्स मिक्स करण्यात आले. त्यानंतर हे मिश्रण ४ °C तापमानावर १० मिनिटांसाठी १५,००० × g वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आले आणि खालचा थर पॉझिटिव्ह व निगेटिव्ह मोडमध्ये एलसी-एमएस विश्लेषणासाठी दोन नळ्यांमध्ये (प्रत्येकी १२५ μL) हस्तांतरित करण्यात आला. शेवटी, हाय-स्पीड व्हॅक्यूम कॉन्सेंट्रेटरमध्ये नमुना पूर्णपणे कोरडा होईपर्यंत बाष्पीभवन करण्यात आला.
वाळवलेले मेटाबोलाइट्स १२० μl ८०% ॲसिटोनायट्राइलमध्ये पुनर्गठित केले गेले, ५ मिनिटांसाठी व्हॉर्टेक्स केले गेले आणि ४°C तापमानावर १० मिनिटांसाठी १५,००० × g वेगाने सेंट्रीफ्यूज केले गेले. मेटाबोलॉमिक्स अभ्यासासाठी सुपरनॅटंट्स मायक्रोइन्सर्ट्स असलेल्या अंबर काचेच्या कुप्यांमध्ये हस्तांतरित केले गेले. अल्ट्रा-परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-हाय-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) प्लॅटफॉर्मवर अनटारगेटेड मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण केले गेले. मेटाबोलाइट्स डायोनेक्स अल्टिमेट ३००० UPLC प्रणाली आणि ACQUITY BEH Amide कॉलम (२.१ × १०० मिमी, १.७ μm, वॉटर्स) वापरून वेगळे केले गेले. पॉझिटिव्ह आयन मोडमध्ये, मोबाइल फेज ९५% (A) आणि ५०% ॲसिटोनायट्राइल (B) होते, ज्यात प्रत्येकी १० mmol/L अमोनियम ॲसिटेट आणि ०.१% फॉर्मिक ॲसिड होते. निगेटिव्ह मोडमध्ये, मोबाइल फेज A आणि B मध्ये अनुक्रमे ९५% आणि ५०% ॲसिटोनायट्राइल होते, दोन्ही फेजमध्ये १० mmol/L अमोनियम ॲसिटेट, pH = ९ होते. ग्रेडियंट प्रोग्राम खालीलप्रमाणे होता: ०–०.५ मिनिटे, २% B; ०.५–१२ मिनिटे, २–५०% B; १२–१४ मिनिटे, ५०–९८% B; १४–१६ मिनिटे, ९८% B; १६–१६.१ मिनिटे, ९८–२% B; १६.१–२० मिनिटे, २% B. ऑटोसेम्पलरमध्ये कॉलमचे तापमान ४०°C आणि नमुन्याचे तापमान १०°C ठेवण्यात आले होते. प्रवाहाचा दर ०.३ ml/min होता, इंजेक्शनचे प्रमाण ३ μl होते. मोठ्या प्रमाणात डेटा गोळा करण्यासाठी, इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्त्रोतासह असलेले क्यू-एक्झॅक्टिव्ह ऑर्बिट्रॅप मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर सायंटिफिक) फुल स्कॅन मोडमध्ये चालवले गेले आणि त्याला ddMS2 मॉनिटरिंग मोडशी जोडले गेले. एमएस पॅरामीटर्स खालीलप्रमाणे सेट केले होते: स्प्रे व्होल्टेज +3.8 kV/- 3.2 kV, केशिका तापमान 320°C, शिल्डिंग गॅस 40 arb, सहाय्यक गॅस 10 arb, प्रोब हीटर तापमान 350°C, स्कॅनिंग रेंज 70–1050 m/h, रिझोल्यूशन 70,000. एक्सकॅलिबर 4.1 (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून डेटा मिळवला गेला.
डेटाच्या गुणवत्तेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, प्रत्येक नमुन्यातून सुपरनॅटंटचे १० μL अलिक्वॉट्स काढून एकत्रित गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमुने तयार करण्यात आले. UPLC-MS प्रणालीच्या स्थिरतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी विश्लेषणात्मक क्रमाच्या सुरुवातीला सहा गुणवत्ता नियंत्रण नमुना इंजेक्शन्सचे विश्लेषण करण्यात आले. त्यानंतर गुणवत्ता नियंत्रण नमुने ठराविक कालावधीने बॅचमध्ये समाविष्ट केले जातात. या अभ्यासातील सीरम नमुन्यांच्या सर्व ११ बॅचेसचे विश्लेषण LC-MS द्वारे करण्यात आले. निष्कर्षण प्रक्रियेवर लक्ष ठेवण्यासाठी आणि बॅच-टू-बॅच परिणामांना समायोजित करण्यासाठी, संबंधित बॅचेसमध्ये १०० निरोगी दात्यांकडून मिळालेल्या सीरम पूल मिश्रणाचे अलिक्वॉट्स संदर्भ सामग्री म्हणून वापरण्यात आले. डिस्कव्हरी कोहोर्ट, अंतर्गत प्रमाणीकरण कोहोर्ट आणि बाह्य प्रमाणीकरण कोहोर्टचे अनटारगेटेड मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण सन यट-सेन विद्यापीठाच्या मेटाबोलॉमिक्स सेंटरमध्ये करण्यात आले. ग्वांगडोंग युनिव्हर्सिटी ऑफ टेक्नॉलॉजी ॲनालिसिस अँड टेस्टिंग सेंटरच्या बाह्य प्रयोगशाळेने क्लासिफायर मॉडेलच्या कामगिरीची चाचणी घेण्यासाठी बाह्य कोहोर्टमधील ४० नमुन्यांचे विश्लेषण देखील केले.
निष्कर्षण आणि पुनर्गठन केल्यानंतर, मल्टीपल रिॲक्शन मॉनिटरिंग (MRM) मोडमध्ये इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्त्रोतासह अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-टँडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ॲजिलेंट 6495 ट्रिपल क्वॉड्रुपोल) वापरून सीरम मेटाबोलाइट्सचे परिपूर्ण परिमाणीकरण मोजले गेले. मेटाबोलाइट्स वेगळे करण्यासाठी एक ॲक्विटी बीईएच अमाइड कॉलम (2.1 × 100 मिमी, 1.7 μm, वॉटर्स) वापरण्यात आला. मोबाइल फेजमध्ये 10 mmol/L अमोनियम ॲसिटेट आणि 0.1% अमोनिया द्रावणासह 90% (A) आणि 5% ॲसिटोनाइट्राइल (B) यांचा समावेश होता. ग्रेडियंट प्रोग्राम खालीलप्रमाणे होता: 0–1.5 मिनिटे, 0% B; 1.5–6.5 मिनिटे, 0–15% B; 6.5–8 मिनिटे, 15% B; 8–8.5 मिनिटे, 15%–0% B; ८.५–११.५ मिनिटे, ०% बी. ऑटोसेम्पलरमध्ये कॉलमचे तापमान ४० °C आणि नमुन्याचे तापमान १० °C ठेवण्यात आले होते. प्रवाह दर ०.३ मिली/मिनिट होता आणि इंजेक्शनचे प्रमाण १ μL होते. एमएस पॅरामीटर्स खालीलप्रमाणे सेट केले होते: केशिका व्होल्टेज ±३.५ kV, नेब्युलायझर दाब ३५ psi, शीथ गॅस प्रवाह १२ लिटर/मिनिट, शीथ गॅस तापमान ३५०°C, ड्रायिंग गॅस तापमान २५०°C, आणि ड्रायिंग गॅस प्रवाह १४ लिटर/मिनिट. ट्रिप्टोफॅन, पायरुवेट, लॅक्टेट, हायपोझॅन्थिन आणि झॅन्थिन यांचे एमआरएम रूपांतरण अनुक्रमे २०५.०–१८७.९, ८७.०–४३.४, ८९.०–४३.३, १३५.०–९२.३ आणि १५१.०–१०७.९ होते. मास हंटर बी.०७.०० (ॲजिलेंट टेक्नॉलॉजीज) वापरून डेटा गोळा करण्यात आला. सीरमच्या नमुन्यांसाठी, मानक मिश्रण द्रावणांच्या कॅलिब्रेशन वक्रांचा वापर करून ट्रिप्टोफॅन, पायरुवेट, लॅक्टेट, हायपोझॅन्थिन आणि झॅन्थिन यांचे प्रमाण निश्चित करण्यात आले. पेशींच्या नमुन्यांसाठी, ट्रिप्टोफॅनचे प्रमाण अंतर्गत मानक आणि पेशी प्रथिनांच्या वस्तुमानानुसार सामान्यीकृत करण्यात आले.
कंपाउंड डिस्कव्हरी ३.१ आणि ट्रेसफाइंडर ४.० (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून पीक एक्सट्रॅक्शन (m/z आणि रिटेन्शन टाइम (RT)) केले गेले. बॅचेसमधील संभाव्य फरक दूर करण्यासाठी, चाचणी नमुन्याच्या प्रत्येक वैशिष्ट्यपूर्ण पीकला त्याच बॅचमधील संदर्भ सामग्रीच्या वैशिष्ट्यपूर्ण पीकने विभाजित करून सापेक्ष विपुलता मिळवली गेली. मानकीकरणापूर्वी आणि नंतर अंतर्गत मानकांचे सापेक्ष मानक विचलन परिशिष्ट सारणी ६ मध्ये दर्शविले आहे. दोन गटांमधील फरक फॉल्स डिस्कव्हरी रेट (FDR<0.05, विल्कोक्सन साइन्ड रँक टेस्ट) आणि फोल्ड चेंज (>१.२ किंवा <०.८३) द्वारे वैशिष्ट्यीकृत केले गेले. काढलेल्या वैशिष्ट्यांचा कच्चा MS डेटा आणि संदर्भ सीरम-सुधारित MS डेटा अनुक्रमे परिशिष्ट डेटा १ आणि परिशिष्ट डेटा २ मध्ये दर्शविला आहे. पीक ॲनोटेशन ओळखीच्या चार परिभाषित स्तरांवर आधारित केले गेले, ज्यात ओळखलेले मेटाबोलाइट्स, संभाव्यतः ॲनोटेटेड संयुगे, संभाव्यतः वैशिष्ट्यीकृत संयुग वर्ग आणि अज्ञात संयुगे २२ यांचा समावेश आहे. कंपाउंड डिस्कव्हरी ३.१ (mzCloud, HMDB, Chemspider) मधील डेटाबेस शोधांवर आधारित, प्रमाणित मानकांशी जुळणारे MS/MS किंवा mzCloud (स्कोर > ८५) किंवा Chemspider मधील अचूक जुळणारे एनोटेशन्स असलेले जैविक संयुगे अखेरीस डिफरेंशियल मेटाबोलॉममधील इंटरमीडिएट म्हणून निवडले गेले. प्रत्येक वैशिष्ट्यासाठी पीक एनोटेशन्स सप्लिमेंटरी डेटा ३ मध्ये समाविष्ट आहेत. सम-नॉर्मलाइज्ड मेटाबोलाइट अबंडन्सच्या युनिव्हॅरिएट विश्लेषणासाठी मेटाबोॲनालिस्ट ५.० चा वापर करण्यात आला. मेटाबोॲनालिस्ट ५.० ने लक्षणीयरीत्या भिन्न मेटाबोलाइट्सवर आधारित KEGG पाथवे एनरिचमेंट विश्लेषणाचे मूल्यांकन देखील केले. प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) आणि पार्शियल लीस्ट स्क्वेअर्स डिस्क्रिमिनांट ॲनालिसिस (PLS-DA) यांचे विश्लेषण स्टॅक नॉर्मलायझेशन आणि ऑटोस्केलिंगसह ropls सॉफ्टवेअर पॅकेज (v.1.26.4) वापरून केले गेले. नोड्यूल मॅलिग्नन्सीचा अंदाज लावण्यासाठी इष्टतम मेटाबोलाइट बायोमार्कर मॉडेल लीस्ट ॲब्सोल्यूट श्रिंकेज अँड सिलेक्शन ऑपरेटर (LASSO, R पॅकेज v.4.1-3) सह बायनरी लॉजिस्टिक रिग्रेशन वापरून तयार केले गेले. pROC पॅकेज (v.1.18.0.) नुसार ROC विश्लेषणावर आधारित AUC चा अंदाज लावून डिटेक्शन आणि व्हॅलिडेशन सेट्समधील डिस्क्रिमिनांट मॉडेलच्या कामगिरीचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यात आले. मॉडेलच्या कमाल युडेन इंडेक्स (सेन्सिटिव्हिटी + स्पेसिफिसिटी – 1) च्या आधारावर इष्टतम संभाव्यता कटऑफ मिळवण्यात आला. थ्रेशोल्डपेक्षा कमी किंवा जास्त मूल्ये असलेल्या नमुन्यांना अनुक्रमे सौम्य गाठी आणि फुफ्फुसाचा ॲडेनोकार्सिनोमा म्हणून भाकीत केले जाईल.
A549 पेशी (#CCL-185, अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन) १०% FBS असलेल्या F-12K माध्यमात वाढवण्यात आल्या. SLC7A5 ला लक्ष्य करणारे शॉर्ट हेअरपिन RNA (shRNA) अनुक्रम आणि एक नॉनटार्गेटिंग कंट्रोल (NC) हे pLKO.1-puro या लेंटिव्हायरल व्हेक्टरमध्ये समाविष्ट करण्यात आले. shSLC7A5 चे अँटीसेन्स अनुक्रम खालीलप्रमाणे आहेत: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 (#5347) आणि ट्युब्युलिन (#2148) च्या अँटीबॉडीज सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजीकडून खरेदी करण्यात आल्या. वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषणासाठी SLC7A5 आणि ट्युब्युलिनच्या अँटीबॉडीज १:१००० च्या विरलतेवर वापरण्यात आल्या.
सीहॉर्स एक्सएफ ग्लायकोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट बाह्यकोशिकीय आम्लीकरण (ECAR) पातळी मोजते. या चाचणीमध्ये, ECAR द्वारे मोजल्या जाणाऱ्या पेशीय ग्लायकोलिटिक क्षमतेची चाचणी घेण्यासाठी ग्लुकोज, ऑलिगोमायसिन ए आणि २-डीजी हे अनुक्रमे दिले गेले.
नॉन-टार्गेटिंग कंट्रोल (NC) आणि shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ने ट्रान्सफेक्ट केलेल्या A549 पेशी १० सेमी व्यासाच्या डिशमध्ये रात्रभर ठेवण्यात आल्या. पेशींमधील मेटाबोलाइट्स १ मिली बर्फ-थंड ८०% जलीय मेथॅनॉलने काढण्यात आले. मेथॅनॉल द्रावणातील पेशी खरवडून काढण्यात आल्या, एका नवीन ट्यूबमध्ये गोळा करण्यात आल्या आणि ४°C तापमानावर १५ मिनिटांसाठी १५,००० × g वेगाने सेंट्रीफ्यूज करण्यात आल्या. ८०० µl सुपरनॅटंट गोळा करा आणि हाय-स्पीड व्हॅक्यूम कॉन्सेंट्रेटर वापरून वाळवा. त्यानंतर, वर वर्णन केल्याप्रमाणे LC-MS/MS वापरून वाळलेल्या मेटाबोलाइट पेलेट्समधील ट्रिप्टोफॅनच्या पातळीचे विश्लेषण करण्यात आले. A549 पेशींमधील (NC आणि shSLC7A5) पेशीय NAD(H) ची पातळी उत्पादकाच्या सूचनांनुसार क्वांटिटेटिव्ह NAD+/NADH कलरिमेट्रिक किट (#K337, बायोव्हिजन) वापरून मोजण्यात आली. मेटाबोलाइट्सचे प्रमाण सामान्य करण्यासाठी प्रत्येक नमुन्यातील प्रथिनांची पातळी मोजण्यात आली.
नमुन्याचा आकार प्राथमिकरित्या निश्चित करण्यासाठी कोणत्याही सांख्यिकीय पद्धती वापरल्या गेल्या नाहीत. बायोमार्कर शोधासाठी केलेले मागील मेटाबोलॉमिक्स अभ्यास¹⁵,¹⁸ हे आकार निश्चितीसाठी मापदंड मानले गेले आहेत, आणि या अहवालांच्या तुलनेत आमचा नमुना पुरेसा होता. अभ्यास गटातून कोणताही नमुना वगळण्यात आला नाही. लक्ष्यहीन मेटाबोलॉमिक्स अभ्यासांसाठी सीरम नमुने यादृच्छिकपणे एका शोध गटात (३०६ प्रकरणे, ७४.६%) आणि एका अंतर्गत प्रमाणीकरण गटात (१०४ प्रकरणे, २५.४%) विभागले गेले. आम्ही लक्ष्यित मेटाबोलॉमिक्स अभ्यासांसाठी शोध संचातून प्रत्येक गटातून ७० प्रकरणे यादृच्छिकपणे निवडली. एलसी-एमएस डेटा संकलन आणि विश्लेषणादरम्यान संशोधकांना गट विभागणीबद्दल माहिती दिली गेली नाही. मेटाबोलॉमिक्स डेटा आणि पेशी प्रयोगांचे सांख्यिकीय विश्लेषण संबंधित निकाल, आकृती स्पष्टीकरण आणि पद्धती विभागांमध्ये वर्णन केले आहे. पेशींमधील ट्रिप्टोफॅन, एनएडीटी आणि ग्लायकोलिटिक क्रियाशीलतेचे प्रमाणीकरण तीन वेळा स्वतंत्रपणे केले गेले आणि त्याचे परिणाम एकसारखेच आले.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी संबंधित असलेला नॅचरल पोर्टफोलिओ रिपोर्टचा सारांश पहा.
काढलेल्या वैशिष्ट्यांचा कच्चा एमएस डेटा आणि संदर्भ सीरमचा सामान्यीकृत एमएस डेटा अनुक्रमे परिशिष्ट डेटा १ आणि परिशिष्ट डेटा २ मध्ये दर्शविला आहे. विभेदक वैशिष्ट्यांसाठी पीक एनोटेशन्स परिशिष्ट डेटा ३ मध्ये सादर केले आहेत. LUAD TCGA डेटासेट https://portal.gdc.cancer.gov/ येथून डाउनलोड केला जाऊ शकतो. आलेख काढण्यासाठी लागणारा इनपुट डेटा मूळ डेटामध्ये दिलेला आहे. या लेखासाठी मूळ डेटा प्रदान केला आहे.
राष्ट्रीय फुफ्फुस तपासणी अभ्यास गट, इत्यादी. कमी-डोस संगणकीय टोमोग्राफीद्वारे फुफ्फुसाच्या कर्करोगामुळे होणारे मृत्यू कमी करणे. उत्तर इंग्लंड. जे. मेड. 365, 395–409 (2011).
क्रेमर, बीएस, बर्ग, केडी, एबरले, डीआर आणि प्रॉफेट, पीसी कमी-डोस हेलिकल सीटी वापरून फुफ्फुसाच्या कर्करोगाची तपासणी: राष्ट्रीय फुफ्फुस तपासणी अभ्यासाचे (NLST) परिणाम. जे. मेड. स्क्रीन 18, 109–111 (2011).
डी कोनिंग, एचजे, एट अल. एका यादृच्छिक चाचणीमध्ये व्हॉल्यूमेट्रिक सीटी स्क्रीनिंगद्वारे फुफ्फुसाच्या कर्करोगामुळे होणारी मृत्यूची संख्या कमी करणे. नॉर्दर्न इंग्लंड. जे. मेड. 382, ​​503–513 (2020).